酶标法的基本理论和技术

井冈山医专学报5992卷第年第4期1酶标法的基本理论和技术周木兰△免疫酶标技术由于具有灵敏度高特异性强操作简便快速无放射性物质污染和不需要昂贵仪器设备等优点已成为当今应用最广发展最快的免疫标记技术之一t、。、、、素都可能使抗体活性下降故抗血清效价必需在l:,2以上3。(用双向琼脂扩散法测定):,第二是纯度高。]l而酶联,应从高效价的抗血清中提纯,IgG用以免疫吸附试验简称酶标法、、、ILSA)E是根据酶(有提高特异性抗体纯度才能减少酶标记只免疫测定发展的二种固相免疫酶技术它具有简便快速准确特异性强灵敏度高可重复性强试剂制备容易稳定有效期长剂量少设备为一般实验室所具备易于推广等优点结果可以用肉眼观察也可借助简单仪器作定量测定是临床和实验室最常用的方法目前广泛应用于各种抗原和抗体的检[l测.、。,,,,,,,、、、、、的不必要消耗和减少试验过程中的非特异的显色。一般常用家兔制备抗血清并用亲和层,析来分离高纯度高效价的坛G也可用硫酸胺沉淀法从抗血清中提取记效果亦很满意22、,lgG,再进行酶标,。酶的要求制备酶标记物的酶应具备纯度高特异,,、、、,’〕本文主要综述酶标法的原理试剂制、、。、备实验条件操作程序临床应用及近年来的某些新进展l1性高稳定可溶性敏感与底物作用后可快速显色与抗原或抗体结合后仍保留酶的活性,原理1[2,〕。抗原或抗体通过物理吸附结合到固相,。221目前常用的酶有辣根过氧化物酶,载体表面但仍具有免疫反应性和抗原活性12](HRP):[该酶活性强标记的抗体能长期保,,结合物与相应的抗体或抗原反应形成,,,、,存。免疫复合物结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时催化底物水解氧化和还原从而产生有色物质13过氧化物广泛存在于植物界辣根过氧化物酶是从辣根中提取的它是由无色的酶蛋白与深棕色的铁叶啦结合而成的一种糖蛋白分子量约红素。,,。。颜色反应的深浅与相应,。的抗原或抗体量成正比故可进行定量分析4万该酶的辅基主要是氧化血,,抗原或抗体与酶结合后所形成的结合物(即酶标记物)仍保留免疫反应性和酶活性2。过氧化物酶的作用底物是过氧化氢催化时需要供氢体反应如下,:酶标记物的制备酶标记物中的三个组成部分是抗体酶、、。HRP+HoZZ条Z(HRPHo,,)结合剂21eHRPHoZ+供氢体一H:毒HRP+抗体的要求第一是高效价由于标记过程中各种因:△病原学教研室(343000)井冈山医专学报995年第卷第4期供氢体+z:O)(:、:为化学平衡常数)例底物(供氢体)为联苯二胺,则反应为层IRPH:N一<二〕卜~《二D卜-NH:十H:O:(无色)一NH一喊仁二)一咬二公>一NH+ZHZO(徐色)222碱性磷酸酶(AKP)其作用是催化磷酸水解释放无机磷O___.Re()一尸土一州口H,R一OH+H:PO-)0H}e问+H,0(相兰磷酸脂(羌色)2.3结合剂的选择结合剂作用原理:是通过双功能基团将酶以共价健的形式,间接联到抗体分子上,或将酶分子氧化,产生活性基团再与抗体分子结合。2..31戍二醛带有活性醛基,它能与酶分子及免疫球蛋白分子的氨基结合形成结合物。OOllE一NH:+C一(CH,):一仁+HZN一19HHIIHHI戍二醛19一E一N目城二一(CHZ)3泛一N+ZHZo(酶免疫球蛋白结合物)标记的抗体质量可能与戍二醛质量有关,纯戍二醛(单体)在波长280nm以下呈较强的吸收峰,为提高结合峰一,应争取使用新鲜纯品,不纯物过多的制品可用葡聚糖凝胶加以纯化。232过碘酸钠标记,是将过氧化物酶中的碳水化合物氧化成醛类,再与蛋白质氨基结合。这种方法约有70%的辣根过氧化物酶被峨合乳”抓的兔分子上,提高了酶和’g的,、忆1机可略食卜亿今凑必吞笼。户’堪\\,月`’分子.酶与19克分子比值过大的结合物,免疫活性低,非特异性显色强。此法不足处是各批间差异大,重复性差24结合物的鉴定采用双“扩”和免疫电泳法,使抗原、抗体反应产生沉淀线,用NS和PBS漂洗数次后,用蒸馏水漂洗一次,最后用琼脂板浸于该酶的底物溶液中,若出现特有的显色反应,则表示抗体有酶的活性。么5酶结合物的保存冻干保存或分成一次使用量后低温(一20℃一4。℃)保存一年半内,活性可保持不变,也可用30%甘油4℃保存。注意:叠氮钠可抑制过氧化物酶活性,故保存时,切勿用叠氮钠防腐。3实验余件选择31固相载体一聚苯乙烯微凹孔鉴定将抗原吸附凹孔,然后各孔加入同一稀释度血清,读取各孔OD值(消化值),求总均值与相邻或上下孔平均值相差不大于10%者,且对阳性、阴性血清不同稀释度的OD值,须有明显差别,则此板可作抗原吸附的良好、均一的合格板。.32测定抗原稀释度。取OD值为10为最适抗原稀释度,假设适宜稀释度为1:2560~l:512033滴定标记物确定适宜浓度:取OD值为10作适宜浓度,根据酶的活性与抗IgG的纯度,一般采用的适宜浓度为1:1600~l:3200。34底物选用何种底物,取决于选哪种酶。每一种酶与自己相应的底物作用,才能产生有色反应物,故底物可称为显色剂。特殊的底物与标记物作用显示了抗原抗体复合物的存在。根据反应物颜色的深浅,可检测抗体的存在量。辣根过氧化物酶(HRP)结合物的底物,一锹采用邻笨二胺叩。其配制法:先配制PH--~~......口5。磷酸一柠橄酸缓冲液,临用前溶解邻苯二胺40mg再加入双氧水015ml.终止反应液用ZM硫酸。碱性磷本酶结合物的底物,一般采用对硝基苯磷酸盐。其配制法为:以10%二乙醉胺溶解对硝基苯磷酸盐sgm,使成含童为lmgm/1,临用时配制.终止反应液用3MNaOH。`35标本处理待检标本(血清等)用含有湿润剂的缓冲液稀释,其中可加入一些蛋白质,以减少非特异性吸附,最后浓度为1%。多数情况下不稀释,或只稀释一个稀释度。4裸作租序41间接法闭:应用于测定抗体。411将有关抗原吸附于固相载体,经温育后缓冲液冲洗.412加入待侧抗体的粉释血清,温育后冲洗。413加入醛标记的特异性免疫球蛋白,温育后冲洗。414加入酶底物(或称基质),底物在酶促反应下出现颜色反应。颇色深浅程度,变化速度与待测血清中抗体含t有关。42夹心法(双抗法)[s〕:侧抗原或抗体例:双抗法侧抗原421将含有特异性抗体(或纯化的特异性免疫球蛋白)吸附在固相载体上,温育清洗。422将含有抗原的待检液与致敏的固相载体温育后冲洗。423加入酶标记的特异性抗体(酶结合物)温育后冲洗。424加酶底物,颇色改变与待侧液中抗原t成正比。如测抗体,即将酶标记上相应的抗原,并将(l)中换成特异性抗原。4.3竞争澎幻又称酶联抗原竞争法,测定抗原(可泌小井冈山医专学报995年第卷第4期分子抗原()见图示)431将特异性抗体(或含有特异性抗体的免疫球蛋白)吸附于固相载体上,温育后清洗;2a加入含有抗原的待测液,再加入酶标抗原温育后清洗.2b为对血孔,仅加入酶标抗原,温育冲洗432各加入酶的底物,待检液中抗原含量与差数成正比4..33结果:即a3和b3的奴色之差别等于未知抗原量。抗原竞争法1()已知抗体吸附于载体2()a加酶标记抗原+可能含抗原的待检液〔“馨睿馨.2()b加酶标记抗原`乍添峪妇万。督睿.井冈山医专学报1995年第2卷第4期3a加酶作用底物口酶作用底物3b加酶作用底物耳!.l卜lesl一公-心各入氏火|日夺仁.于一.-t-r.E令叫心;一-卜口1石:0,o`暨量.被酶水解后的底物图:酶联免疫吸附试验底物水解量~酶标记抗原量3()b一(3a)=待检溶液中的抗原量.44竞争抑制法441包“被”已知抗原,37℃4h或4℃过夜。.4.42加入予反应物(即待测抗原与相应抗体反应混合物),37℃lh.443包被抗原与予反应物中多余的相应抗体起反应。73℃lh,弃去其内液,洗涤三次。.4.44加酶标记特异性抗体(即酶标葡萄球菌A蛋白)与复合物反应,73℃半小时,洗涤三次。445加底物:邻苯二胺+HZ。37,C15分钟446中止反应:加ZMHZSO4.4.47光电比色:用光电比色计,波长490nm测OD值448结果:颜色改变与待测液中抗原量成正比。即测出样品中抗原量增加,与予反应物抗血清的结合率亦增高。而反应板上所包被的抗原与抗血清的结合率下降,则显色反应浅。5临床应用ELsIA是一种简单、方便、易普及的小分子(如药物、激素、维生素、毒素、辅酶等)测定方法闭,其敏感度可测到mg/ml水平,广泛应用于微生物、寄生虫、细胞(肿瘤细胞)表面标志、细胞因子、血清蛋白、激素等抗原、抗体的检测,以诊断、研究传染病(含寄生虫病)、肿瘤、免疫性疾病、内分泌性疾病等多种疾病。如在肝炎病毒抗原(抗体)、甲胎蛋白等的检测中,ELISA是一种主要方法][;.伤寒杆菌、白色念珠菌、囊虫、弓形虫等抗原、抗体,重症肌无力抗烟碱型乙酞胆碱变体闭、白血病患者粒系集落刺激因子.t]、肺癌患者P“抗体[0l〕、孕妇HCG[l’1,还有霍乱肠毒素、载脂蛋白[zl〕、细胞粘附因子和其它白细胞表面抗原[sl〕、白细胞介素一2[l’]、抗核抗体(ANA)、McAb[51)等等,临床都是用EILSA法检测,并且血清透明质酸、孕血清中早孕因子等川一’幻各种物质EILSA法检测的不断建立,使更多疾病的诊断、研究成为可能。ELsIA的临床应用有着广阔前景。6近年来的某些新进展61改良ELIsA:选择最佳的操作程序或酶的底物,不断改良ELISA,是当前一大潮流.陈丙莺等[0l〕以检测血清蛋白为例,选择的最佳孵育时间为73℃51mm,使整个ELISA操作流程在lh内完成。徐莉豫等02[〕用抗细胞膜单克隆抗体ELISA改良法筛选抗细胞膜单克隆抗体杂交瘤;张阳根等[zl〕对检测弓形虫IgM抗体ELISA法进行改良,亦获得了更好的效果。肖红等卿〕报道ABTS(22一连氮基双一3一乙基一苯丙唾哇琳瑛胺)作为辣根过氧化物酶底物的换代产品,具有酶感,特异性强、简便、实用等优点,还不必担心前后读取OD值的不同而造成人为因素的差异,应用前景广阔。62BAS一ELISA:是70年代后期在免疫酶技术中利用生物素一亲合素BAS系统标记抗体发展的一种新型生物反应放大技术,此法比常规ELISA的敏感性提高4一61倍[l.2〕,如江克庆等用ABC一ELISA检测抗HBI(gM)较常规ELISA法敏感性提高4倍[,,一。63odt一ELISA:斑点一酶联免疫吸附试验,又称斑点免疫结合试验(DBIA)是以ELISA发展而来一类简便、快速的标记免疫测定方法,其特点是以微孔薄膜(常用硝酸纤维素膜)作载体,酶免疫反应阳性结果在膜上出现着色斑点,已用于检查HCG作早孕诊断,测定血清中甲胎蛋白及某些传染病原以作快速诊断,如A族链球菌、轮状病毒、衣原体等,以及风疹病毒,人类免疫缺陷病毒(HIV)等的抗体检测,并已制成多种试验盒,使免疫检测技术开始进入“医生诊所化验”及“家庭化验”的实用阶段。l[]应用这种方法,童明庆等)〕检测出幽门螺杆菌抗体IgG,黄俏佳等l[`〕检测尿液绒毛膜促性腺激素,都获得了更佳效果。64MAC一ELISA:IgM抗体捕捉酶联免疫吸附试验或称反间间接ELISA法,是利用抗林链特异性抗体包被固相载体,吸附特检血清中的IgM,加入特异性抗原与“捕捉”到的相应IgM抗体结合,然后加入酶标记抗体及底物进行测定,此法特异性、敏感性均较高,不受血清中IgG、类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)等的干扰,目前已广泛用于检测特异性IgM抗体,作为各种感染性疾病的早期辅助诊断方法lj[。近份年来,免疫学飞跃发展的成就是不胜枚举的,作为教师应不断更新知识,熟悉和掌握免疫检测新技术,不断改进教学方法,更井冈山医专学报15年第992卷第4期新教学内容,以适应临床免疫诊断技术不断发展的需要。参考文献1毕爱华主编医学免疫学北京:人民军医出版社,1995:304~3082郑武飞主编医学免疫学北京:人民卫生出版社,1989:121~1233周本正主编医学技术实用全书北京:科学技术文献出版社,1995:481~4834于利凌,等间接ELlsA检测抗核抗体及其临床应用上海免疫学杂志,1995,15(1):365,许龙善等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