愈创木酚法测定过氧化物酶活性准确,无误

愈创木酚法测定过氧化物酶活性

一、实验目的

过氧化物酶它与呼吸作用、 光合作用及生长素的氧化等都有密切关系， 在植 物生长发育过程中， 它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 通过本实 验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、实验原理

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产 物在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测 470 nm下的吸光度变化测定过氧 化物酶的活性。

三、实验材料 马铃薯块茎。

四、设备与试剂

分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

0.05 mol •_的磷酸缓冲液（pH 5.5）; 0.05 mol I愈创木酚溶液；2% H2O2; 20％三氯乙酸

五、实验步骤

（一） 酶液的制备

取1.0〜5.0 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓 冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000x g离心10 min,上清液 转入 25 mL 容量瓶中。 沉淀用 5 mL 磷酸缓冲液再提取两次， 上清液并入容量瓶 中，定容至刻度，低温下保存备用。

（二） 过氧化物酶活性测定

酶活性测定的反应体系：依次加入2.9 mL 0.05 mol -L-1磷酸缓冲液；1.0 mL 2% H2O2; 1.0 mL 0.05 mol -L-1愈创木酚和0.1 mL酶液。用加热煮沸5 min的 酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于 34C水浴中保温3 min，然后迅速稀 释1倍，470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度A470，共记录5次， 然后以每分钟内 A470 变化 0.01 为

1 个酶活性单位（ U）。

六、实验结果

以每分钟内 A470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ U）。

△A470 x VT

过氧化物酶活性（U - g-1 - min-1）= ----------------------

Wx VSx0.01 xt

式中：△ A470——反应时间内吸光度的变化；

W ——马铃薯鲜重（ g）；

t 反应时间（min）；

VT――提取酶液总体积（mL）;

VS ――测定时取用酶液体积（mL）。

七、注意事项 酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。 H2O2 要在反应开始前加， 不能直接加入。