南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析

30（9）：1706～1715核农学报2016，

JournalofNuclearAgriculturalSciences

8551（2016）09-1706-10文章编号：1000-

南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和

转录组关联分析

马

摘

进郑钢裴翠明张振亚

（浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江临安311300）

以南方型紫花苜要：为了从基因和蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制，

蓿Millennium为材料，对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品叶片进行转录组和蛋白质组关联分析。

结果表明，定量蛋白和基因关联系数为0.2485；变化趋势相反差异蛋白和基因表达的关联系数为－0.2440；变化趋势相同差异蛋白质和基因表达的关联系数为0.8122。鉴定出109个与差异基因表达

32个下调，趋势相同的差异蛋白，其中77个上调，这些差异蛋白功能涉及光合作用、抗氧化物、信号传递、翻译后修饰、翻译和分子伴侣、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其它未知功能蛋白等。下调表达

的蛋白主要与光合作用相关，而上调表达的蛋白主要参与了抗氧化物、信号传递和胁迫防御等。此外，关联发现了与紫花苜蓿盐胁迫响应相关的III类过氧化物酶、铁蛋白、谷胱甘肽S－转移酶、磷脂酰肌醇

+

LＲＲ类受体激酶、ABA反应蛋白、特异性磷脂酶C、钙联接蛋白2、液泡H－ATP酶C亚基和NADP－

苹果酸酶等差异蛋白。本研究通过高通量多组学数据的关联分析，发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白（基因），这为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础。关键词：南方型紫花苜蓿；盐胁迫；蛋白质组；转录组；关联DOI：10.11869/j．issn．100-8551.2016.09．1706土壤盐化是全球面临的严峻的环境问题之一。研究植物盐胁迫响应基因的生物学功能，有助于了解植物耐盐分子机制，为培育耐盐植物新品种提供理论依据。紫花苜蓿（MedicagosativaL．）作为牧草在全世界

2

广泛种植，在我国种植面积达183万hm，居世界第5

［1］

通过引进国外位，种植地区以北方为主。近年来，

耐高温高湿的紫花苜蓿品种，克服了紫花苜蓿在我国南方不能种植的难题，但紫花苜蓿是对高浓度盐分敏感的甜土植物，耐盐能力有限，限制了其在南方盐碱地的种植。利用现代生物学技术，创制南方型紫花苜蓿耐盐新种质首先依赖于发掘和鉴定与盐耐性相关的基因，阐明南方型紫花苜蓿盐胁迫应答的关键分子机制和调控机理。

迄今为止，国内外研究者已成功克隆了一些紫花

［2］［3］

苜蓿耐盐基因，如MsPＲP2、MsP5CS－1、MsPDH［4］、MsMH1［5］、MSLEA3－1［6］、MsGＲP［7］、

09-01收稿日期：2015-02-29接受日期：2016-

MsGME［8］、MsSIK1［9］、MsNAC2和MsＲCI2A［10］。此外，

Yacoubi等［11］通过对盐胁迫下渗透调节处理和未渗透调节处理的紫花苜蓿的蛋白质组学进行分析，鉴定出94个盐胁迫差异蛋白。Olga等［12］以耐盐性不同的紫花苜蓿为研究对象，通过转录组分析鉴定出多个盐胁迫应答基因。紫花苜蓿的耐盐性是由多个QTL基因位点控制的复杂性状，是一个复杂的调控网络机制。目前国内外对紫花苜蓿耐盐分子机制研究局限于单个基因、单个组学水平上，而通过高通量多组学数据的整合分析，诠释紫花苜蓿耐盐分子调控机制的研究较为鲜见。

高通量组学分析工具的发展，引导系统生物学进入大数据时代，在单组学研究显现瓶颈之际，可通过多组学整合关联分析，深入阐明生命活动的本质和规律。基因是遗传信息的携带者，而蛋白质则是基因功能的执行者。在基因控制蛋白质合成的过程中，涉及到一

浙江省自然科学基金（LY16C170003）基金项目：国家自然科学基金（31272494），

mail：majinzjl@163．com副教授，主要从事植物逆境生理研究。E-作者简介：马进，通讯作者：同第一作者。

9期南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析1707

整套精细的表达调控机制，如转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控等。因此，要全面探究生物体的复杂生命活动，需要检测mＲNA和蛋白质的表达量，并进行组学数据整合分析，为从系统层次揭示生物

［13－14］

。本研体的复杂生命活动的调控规律奠定基础

究以南方型紫花苜蓿幼苗叶片为材料，运用转录组测

法

PAGE检测后取进行蛋白的浓度测定，经SDS-等量蛋白进行Trypsin酶解。处理点采用2次生物学重复，用iTＲAQ（isobarictagsforrelativeandabsolute

quantitation）117，113标记未经处理的幼苗叶片蛋

ITＲAQ115，119标记250mol·L－1NaCl盐胁迫72白，

［17］

序和定量蛋白组技术鉴定紫花苜蓿叶片响应盐胁迫差

异表达基因和差异蛋白，并将获得的蛋白质组与转录组数据进行关联分析，以期发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白（基因），为紫花苜蓿盐胁迫的应答分子机制研究奠定基础。

h幼苗叶片蛋白，119/组成2个比对组（115/117，

113），对混合后将标记好的4组样品进行等量混合，的肽段使用强阳离子交换色谱（strongcationexchangechromatography，CX）进行预分离，再进行液相串联质谱（liquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry，LC-MS/MS）分析［18］。利用蒺藜苜蓿转录组预测蛋白数据库和Mascot软件进行蛋白质鉴定，当蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上或0.833倍以下，且经统计检验其p值小于0.05时，视为差异蛋白。1.4关联分析

采用Lan等的方法在蛋白水平和转录水平计算皮尔逊Pearson相关系数，确定蛋白和mＲNA的相关性的强弱。

［19］

1

1.1

材料与方法

材料及处理

以美国引进的耐盐性相对较强的高秋休眠级紫花

苜蓿Millennium为材料，将种子先用75%酒精消毒10min，然后用灭菌水清洗3次，灭菌水中浸泡2h后于20℃生长箱内发芽。7d后，挑选生长一致的小苗转移至装满细沙和珍珠岩（3∶1）的塑料盆，每天浇Hogland营养液。30d后加入250mmol·L－1NaCl至营养液中处理，选取胁迫处理0h和72h的紫花苜蓿叶片于液氮中保存备用。1.2

转录组数据分析

利用北京TIANGEN公司的TＲNzolＲeagent试剂盒按照说明提取幼苗叶片ＲNA。所提取的ＲNA经电泳检测合格后送至深圳华大基因科技有限公司进一步确认质量后，进行高通量测序。将盐处理组与对照组总ＲNA由华大基因科技有限公司完成文库构建与测序，将构建好的文库进行质量和产量检测。对质量检测合格后的文库采用IlluminaHiSeqTM2000（Illumina，美国）进行测序。将经BaseCalling测序产生的原始图像转化为序列数据（Ｒawdata），继而转换为Cleandata［15］。采用短reads比对软件SOAPaligner/SOAP2将Cleanreads分别与参考基因组蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）进行比对。测序后采用百万比对到参考序列/参考基因组上的reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数（readsperkilobasespermillionmappedreads，ＲPKM）来计算基因表达量，根据基因表达量计算其在处理与对照中的差异表达倍数。差异表达倍数大于2倍以上（含2倍）的基因认定为差异表达基因。1.3

蛋白质组数据分析采用丙酮沉淀法

［16］

2

2.1

结果与分析

组学分析

2.1.1

seq测序结果见表1，转录组数据分析ＲNA-使用reads比对软件SOAPaligner/soap2将Cleanreads

分别比对到参考基因序列上。结果发现，对照样本和

盐胁迫处理样本中分别有52.47%和53.07%的Cleanreads可比对到参考序列上，其中，完全匹配序列数在对照和处理2个库里分别是8.46%和7.52%，能够唯一比对到参考序列上的Cleanreads分别是36.43%和34.79%。对照样本和盐胁迫处理样本之间有74974078个差异表达基因个基因表现为差异表达，其中，

3419个表达下调。在盐胁迫响应中表达上调，2.1.2

蛋白质组数据分析在本次质谱试验中共得

到谱图431604张，通过Mascot软件进行分析后，匹配

到的谱图数量是29245张，其中Unique谱图数量为24685张，11649个肽段，共鉴定到3712个蛋白，其中含10595个Unique肽段。在全蛋白质基础上，将2次生物学重复得到的蛋白质数据合并，将其共同表达的蛋白质用于差异蛋白筛选，其中有3712个蛋白共同表达（图1）。进一步鉴定出417个处理与对照组共同表达的差异蛋白，其中上调蛋白291个（P≤0.05，变化倍数＞1.2），变化倍下调蛋白126个（P≤0.05，数＜0.833）。

提取幼苗叶片蛋白质。对提

取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，用Brandford

1708核农学报30卷

表1

Table1

reads概括readssummary

reads的净序列数Cleanreads总碱基对数Totalbasepairs/bp

匹配上基因组的总reads数Totalmappedreads完全匹配序列数Perfectmatch特异匹配的序列数Uniquematch

ＲNA-seq表达谱测序结果

对照样本Controlsample

62771040564939360032933810（52.47%）5308104（8.46%）22864430（36.43%）

处理样本Treatmentsample

60394756543552804032048578（53.07%）4540272（7.52%）21012720（34.79%）

ＲesultofＲNA-seqexpressionprofilesequencing

2.22.2.1

转录组和蛋白质组关联分析

蛋白质组与转录组关联数量关系对相同参

考基因的mＲNA和蛋白质表达情况进行关联，当某一

个基因在mＲNA水平和蛋白质水平均可以检测到表达时，认为这个基因的mＲNA和蛋白质是相关的。在鉴定、定量、显著差异3个范围中，能关联到的蛋白质和基因数量见表2。有3419个基因在mＲNA和蛋白质水平均得到鉴定，其中2008个基因在mＲNA水平

417个差异蛋白中有285个和蛋白质水平均有表达，

同基因关联。

2.2.2蛋白质组与转录组相关性分析

关联到的基

注：A：二级谱图总数；B：匹配到的谱图数量；C：匹配到特有肽段的谱图数量；D：鉴定到的肽段数量；E：鉴定到

特有肽段序列数量；F：鉴定到的蛋白质数量。Note：A：Totalspectranumber．B：Spectranumber．C：Uniquespectranumber．D：Peptidenumber．E：Unique

peptidenumber．F：Proteinnumber．

因在mＲNA层面表达趋势和蛋白质层面表达趋势有多种类型。410个基因在mＲNA水平显著差异表达，在蛋白质水平表达差异不显著；108个基因在蛋白质水平显著差异表达，在mＲNA水平表达差异不显著；109个基因在转录水平和蛋白水平均差异表达且达到

图1Fig．1

iTＲAQ鉴定到蛋白信息ProteininformationofiTＲAQ

表2

Table2

类型

Type

鉴定Identification定量Quantitation

差异表达Differentialexpression

关联转录组和蛋白质组数量

Numberofassociatedtranscriptomandprotem

蛋白质数量Numberofproteins

37122150417

关联数量

Numberofcorrelations

34192008285

基因数量Numberofgenes

313723137211306

本研显著水平。由于组学水平之间存在很复杂的关系，

究通过定量蛋白和基因、差异蛋白和基因变化趋势相反及差异蛋白和基因变化趋势相同3种类型进行关联分

－1

析。由图2可知，紫花苜蓿幼苗叶片在250mmol·LNaCl胁迫72h后，发现定量蛋白和基因呈现正相关，其间的相关性并不高，相关系数为0.2485；表达变化趋势相反差异蛋白和基因表达呈负相关，相关系数为－0.2440；表达变化趋势相同差异蛋白和基因表达呈正相关，相关系数为0.8122，相关性很高。

2.2.3与基因表达变化趋势相同的差异蛋白功能分

通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。将紫花苜蓿叶片响应盐胁析

迫关联到差异蛋白与基因GO功能分类，参与的生物学过程主要包括细胞过程、刺激响应和单一生物进程等；在细胞组分中，表现在细胞、细胞部分、膜、细胞器和细胞器部分等方面；在分子功能主要表现在结合、催化活性和结构分子活性等方面（图3）。

通过与基因表达变化趋势相同的关异蛋白代谢分析，确定蛋白质参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。研究发现，与基因变化趋势相同的差异蛋白分

9期南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析1709

注：A：所有定量蛋白质和基因的表达关联；B：表达变化趋势相反蛋白质和基因表达关联；C：表达变化趋势相同差异蛋白质和基因表达关联。

Note：A：Correlationexpressedquantitativeproteinsandgenes．B：Correlationdifferentiallyexpressedproteinsattheopposite

trendwithexpressiongenes．C：Correlationdifferentiallyexpressedproteinsatthesametrendwithexpressiongenes．

图2

Fig．2

蛋白质与基因表达关联

Correlationexpressedquantitativeproteinsandgenes

注：细胞组分：A：细胞；B：细胞连接；C：细胞部分；D：胞外区域；E：复杂大分子；F：膜；G：膜封闭腔；H：膜部分；I：细胞器；J：细胞器部分。分子功能：A：抗氧化物酶活性；B：结合；C：催化活性；D：电子载体活性；E：酶调控活性；F：结构分子活性；G：转运活性。生物学进程：A：生物调节；B：细胞成分组织或起源；C：细胞过程；D：发育过程；E：局部组织建立；F：生长；G：免疫系统过程；H：定位；I：代谢过程；J：多组织进程；K：多细胞组织进程；L：生物进程负向调控；M：生物学进程调控；N：复制；O：复制进程；P：刺激响应；Q：信号；

Ｒ：单一生物过程。

Note：Cellularcomponent：A：Cell．B：Celljunction．C：Cellpart．D：Extracellularregion．E：Macromolecularcomplex．F：Membrane．G：Membrane-enclosedlumen．H：Membranepart．I：Organelle．J：Organellepart．Molecularfunction：A：Antioxidantactivity．B：Binding．C：Catalyticactivity．D：Electroncarrieractivity．E：Enzymeregulatoractivity．F：Structuralmoleculeactivity．G：Transporteractivity．Biologicalprocess：A：Biologicalregulation．B：Cellularcomponentorganizationorbiogenesis．C：Cellularprocess．D：Developmentalprocess．E：Establishmentoflocalization．F：Growth．G：Immunesystemprocess．H：Localization．I：Metabolicprocess．J：Multi-multicellularorganismprocess．K：Multicellularorganismalprocess．L：Negativeregulationofmolecularfunction．M：Ｒegulationofbiologicalprocess．N：Ｒeproduction．

O：Ｒeproductiveprocess．P：Ｒesponsetostimulus．Q：Signaling．Ｒ：Single-organismprocess．

图3

Fig．3

与基因表达变化趋势相同的差异蛋白GO功能分类

GOcategoriesofdifferentiallyexpressedproteinsatthesametrendwithexpressiongenes

布在71个分类代谢途径中。由于受KEGG数据库注释信息量的限制，只有82.91%差异蛋白可以详细注

释到具体的代谢路径图中。差异蛋白广泛涉及代谢途

径、次生代谢产物生物合成、核糖体、苯丙素生物合成、

1710核农学报30卷

光合作用和丙酮酸代谢等。其中代谢途径、次生代谢产物生物合成、核糖体和苯丙素生物合成等4类代谢35.11%、相关的蛋白分别占差异蛋白的53.44%、

12.98%和7.63%（图4）。

注：A：代谢途径；B：次生代谢产物生物合成；C：核糖体；D：苯丙素的生物合成；E：光合作用；F：苯丙氨酸代谢；G：丙酮酸代谢；H：氨基糖和核苷酸糖代谢；I：亚麻酸代谢；J：糖酵解途径；K：脂肪酸代谢；L：光合生物碳固定；M：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸代谢；N：过氧物酶体；O：淀粉和蔗糖代谢；P：乙醛酸盐代谢；Q：酪氨酸代谢；Ｒ：卟啉与叶绿素代谢；S：缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解；T：植物病原物相互作用；U：其它。Note：A：Metabolicpathways．B：Biosynthesisofsecondarymetabolites．C：Ｒibosome．D：Phenylpropanoidbiosynthesis．E：Photosynthesis．F：Phenylalaninemetabolism．G：Pyruvatemetabolism．H：Aminosugarandnucleotidesugarmetabolism．I：alpha-Linolenicacidmetabolism．J：Glycolysis/Gluconeogenesis．K：Fattyacidmetabolism．L：Carbonfixationinphotosyntheticorganisms．M：Glycine．serineandthreoninemetabolism．N：Peroxisome；O：Starchandsucrosemetabolism．P：Glyoxylateanddicarboxylatemetabolism．Q：Tyrosinemetabolism；Ｒ：Porphyrinandchlorophyllmetabolism．S：Valine．leucineand

isoleucinedegradation．T：Plant-pathogeninteraction，U：Other．

图4

Fig．4

与基因表达变化趋势相同的差异蛋白代谢分类

Pathwayofdifferentiallyexpressedproteinsatthesametrendwithexpressiongenes

2.2.4

与差异基因表达变化趋势相同的差异蛋白

·L－1NaCl胁迫72h时紫花苜蓿幼苗叶片在250mmol

后，鉴定出109个与差异基因表达趋势相同的差异蛋

32个下调。这些差异蛋白功能涉白，其中77个上调，

法，鉴定到的蛋白质数量少，导致定量到的蛋白质与其

［20］

相对应的mＲNA相关系数高，如White等研究表明mＲNA表达水平的改变和蛋白质表达水平改变有较强的正相关性（r=0.810，P＜0.001）。随着高通量测序技术的不断发展与完善，转录组数据和蛋白质组数据

［21］相关程度整体较弱，如Huang等联合分析集胞藻PCC6803（Synechcoystissp．PCC6803）在氮饥饿状态

及光合作用、抗氧化物、信号传递、蛋白质合成、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其它及未知功能蛋白等。下调表达的蛋白主要与光合作用相关，而上调表达的蛋白主要参与了抗氧化物、信号传递和胁迫防御等（图5）。通过关联分析，发现一些可能与紫花苜蓿盐胁迫相关的靶标蛋白，如III类过氧化物酶、丙二烯氧LＲＲ类受体激酶、ABA反应蛋白、化物酶、钙联接蛋白

+

2、液泡H－ATP酶亚基C和NADP－苹果酸酶（表3）。它们可能在紫花苜蓿盐胁迫的应答分子机制中扮演重要角色。

下24h和48h，发现转录组和蛋白质组的相关系数很低，分别为0.0400和－0.0001。本研究通过南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析表明，定量蛋白质和基因关联相关系数为0.2485，关联系数并不高，可能由于mＲNA和相对应的蛋白质表达水平不一致所导致，但与基因表达变化趋势相同的差（r=0.8122，P＜异蛋白质和基因有较强的正相关性，0.001）。此外，在关联分析中也发现，部分差异蛋白mＲNA有及mＲNA变化趋势相反，部分蛋白无变化、差异变化和部分mＲNA无变化、蛋白有变异变化等现象，这可能因为DNA转录成mＲNA及mＲNA翻译成蛋白质的过程中，会受到各种因子对转录、翻译过程的调节及翻译后调控，从而使mＲNA转录子的数目、蛋

3讨论

利用蛋白质组学和转录组学数据，通过蛋白质组

和转录组关联分析方法可以深入理解基因和蛋白质的

内在联系。早期蛋白质组数据测定主要采用双向电泳

9期南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析1711

表3

Table3

关联到同差异基因变化趋势相同的潜在耐盐蛋白trendwithdifferentiallyexpressiongenes

Potentialsalttoleranceproteincorrelationdifferentiallyexpressedproteinsatthesame

蛋白登录号AccessionNo．AES98953.1AES90668.1AES97416.1KEH20685.1AES64777.1AES68507.1AES71155.1AES91348.2AES65088.1AES65087.1KEH27441.1AES74343.2AES75035.1AES92484.1KEH35681.1AES80690.1AET01301.1KEH24408.1

注：+表示上调；－表示下调。

蛋白名称Proteinname

Ⅲ类过氧化物酶ClassIIIperoxidaseIII类过氧化物酶ClassIIIperoxidas丙二烯氧化物酶Alleneoxidecyclasetransferase谷胱甘肽S－转移酶GlutathioneS-铁蛋白Ferritin

LＲＲ类受体激酶LＲＲreceptor-likekinase

specificphospholipaseC磷脂酰肌醇特异性磷脂酶CPhosphatidylinositol-胞外钙敏感受体Extracellularcalciumsensingreceptor

ABA反应蛋白ABA-responsiveproteinresistanceresponseprotein抗病反应蛋白Disease-relatedthaumatinfamilyprotein病程相关基因家族蛋白Pathogenesis-几丁质酶Chitinase丁质酶Chitinase

热激蛋白70kDaHeatshock70kDaprotein

钙联接蛋白2Calnexin2

液泡H+－ATP酶亚基CVacuolarH+－ATPasesubunitC

malicenzymeNADP－苹果酸酶NADP-蔗糖合成酶Sucrosesynthase

蛋白差异倍数

Averageproteinlevelratio

3.1421.9381.4891.5651.8721.9641.2940.6071.4811.5692.0862.4472.9251.4501.3401.3151.3311.566

基因log2值Genelog2value

2.4511.9622.8583.9562.3211.39510.980－1.2371.1581.4681.5343.5175.5023.2339.9801.0272.6191.979

上调/下调Downorupregulated

+++++++－++++++++++

Note：+expressedupregulated．－expresseddownregulated．

数量和功能发生改变。mＲNA并不能完全白质位置、

代表蛋白质的表达水平，单从蛋白质组或转录组层面研究紫花苜蓿应答盐胁迫的分子调控机制是不完整的，通过蛋白质组和转录组关联分析，可为创制南方型紫花苜蓿耐盐新种质寻找到潜在耐盐靶标蛋白（基因）。

在盐胁迫条件下，植物会启动许多盐胁迫响应基

MsP5CS－1、因。目前已在紫花苜蓿中克隆出MsPＲP2、

MsPDH、MsMH1、MSLEA3－1、MsGＲP、MsGME、MsSIK1、MsNAC2和MsＲCI2A［2－10］等耐盐基因，这些基因被证实在紫花苜蓿盐胁迫应答过程中发挥一定作用。植物在遭受盐胁迫时，能够启动抗氧化酶系统来清除活性氧，除低氧化胁迫带来的伤害。III类过氧化物酶（Prxs）是植物特有的酶，过表达III类过氧化物酶蛋白

［22］

基因可增强玉米（ZeamaysL．）抗氧化能力。盐胁迫时铁离子和过氧化氢（H2O2）反应会产生活性氧

，Parker等［24］发现水稻（OryzasativaL．）在盐胁迫响应中，铁蛋白（ferritin）表达上调，从而可以帮助消

［23］

除活性氧。谷胱甘肽S－转移酶（gultathioneS-transferases，GSTs）是生物体内重要的一种解毒和抗氧化物酶类，过表达AtGSTU17增强拟南芥（Arabidopsis

thaliana）的耐盐性［25］。丙二烯氧化物酶（alleneoxidecyclase，AOC）是茉莉酸脂加氧酶合成途径过程中的第1个酶，过表达AOC基因可以提高拟南芥的耐盐。本研究发现，与差异基因表达趋势相同III类过氧化物酶、铁蛋白、谷胱甘肽S－转移酶和丙二烯氧性

化物酶等差异蛋白表达上调，这些上调蛋白有助于消除过多的活性氧，维持紫花苜蓿正常代谢功能。Ca2+作为重要的第二信使，在植物逆境胁迫中发

［27］

挥着重要作用。胞外钙敏感受体（extracellularcalciumsensingreceptor，CaSＲ）表达受细胞外Ca2+浓度的调节，在调节细胞水分吸收、细胞钙稳态和渗透平

［28］

衡方面具有重要作用。本研究发现1个同差异基因表达趋势相同的胞外钙敏感受体差异蛋白在盐胁迫下表达下调，这表明胞外钙敏感受体可能是紫花苜蓿like盐胁迫的负调控因子。类受体激酶（receptor-［26］

1712核农学报30卷

注：A：光合作用；B：抗氧化物；C：信号传递；D：胁迫防御；E：翻译后修饰、翻译和分子伴侣；F：能量产生与转运；G：代谢；

H：其它及未知功能蛋白。

Note：A：Photosynthesis．B：Oxidationresistance．C：Signaltransmission．D：Defenseagainststress．E：Posttranslationalmodification，

proteinturnoverandchaperones．F：Energyandtransport．G：Metabolism．H：Otherandfunctionunknownproteins．

图5

Fig．5

关联到同差异基因变化趋势相同的差异蛋白功能分类

withdifferentiallyexpressiongenes

Functionalclassificationsofcorrelationdifferentiallyexpressedproteinsatthesametrend

kinase，ＲLKs）在植物生长、发育和对环境因素的应激

［29］

LＲＲ-ＲLK基因方面发挥着重要作用。研究表明，

参与烟草（NicotianatabacumL．）盐胁迫响应调控过

［30］

程。本研究发现1个同差异基因表达趋势相同的LＲＲ类受体激酶上调，该蛋白可能是紫花苜蓿叶片参与盐胁迫应答重要调节蛋白。磷脂酰肌醇特异性磷脂

specificphospholipaseC，PI-酶C（phosphatidylinositol-PLC）在响应植物逆境胁迫信号转导途径中发挥重要

［31］［32］

作用。韩冬梅等发现DsPLC可能在盐藻（DunaliellasalinaL．）抵御外界盐胁迫的过程中起重要作用。本研究发现1个与差异基因表达趋势相同的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C表达上调，该蛋白可能是紫花苜蓿叶片参与盐胁迫应答的重要调节蛋白。一些防御相关蛋白在植物响应盐胁迫中起着重要作用。盐胁迫响应下，几丁质酶（chitinase）和病程相related，PＲ）蛋白表达上调，关（pathogenesis-这些蛋白

［33－35］

。可能在应对植物盐胁迫逆境中发挥重要作用responsiveprotein，AＲP）拟南芥ABA反应蛋白（ABA-［36］

参与植物应答盐胁迫响应。本研究发现5个与差异基因表达趋势相同的防御相关蛋白，其中ABA反应蛋白、几丁质酶和病程相关基因家族蛋白表达上调，这些上调蛋白可能在紫花苜蓿叶片响应盐胁迫中发挥着重要作用。

热激蛋白70（heatshockprotein，HSP70）是植物应对高温和其它胁迫环境时所产生的一类特定的应激

［37－38］

。Chen等［39］发现高盐处理后水稻线粒体蛋白

HSP70表达明显上调，导致细胞凋亡减弱，表明HSP70

可能是细胞程序性凋亡的潜在调节者。钙联蛋白（calnexin，Cnx）是一个定位于内质网（endoplasmicreticulum，EＲ）膜上的凝集素样分子伴侣，也参与植物抵抗逆境响应过程

［40］

。本研究发现同差异基因表达

趋势相同的热激蛋白70和钙联接蛋白2在盐胁迫下表达上调，这些上调蛋白可能在紫花苜蓿叶片响应盐胁迫中发挥重要作用。

+

ATPase）在应对多种植物液泡型H－ATP酶（V-+

逆境胁迫中具有重要作用，如超表达液泡H－ATP

［41］

酶C亚基蛋白基因可增加烟草的耐盐性。NADP－

malicenzyme）参与多个代谢过程，苹果酸酶（NADP-过

表达NADP－苹果酸酶可提高拟南芥对盐胁迫的耐受

［42］

性。蔗糖合酶（sucrosesynthase，SS）是蔗糖代谢途径中的关键酶，在干旱胁迫下，花生（ArachishypogaeaL．）蔗糖合酶基因表达上调［43］。本研究发现同差异基因表达趋势相同的超表达液泡H－ATP酶C亚基蛋

NADP－苹果酸酶和蔗糖合酶在盐胁迫下表达上白、

调，这些上调蛋白可能在紫花苜蓿叶片响应盐胁迫中发挥重要作用。

+

4结论

对正常培以南方型紫花苜蓿Millennium为材料，

养和盐胁迫条件下的2个样品叶片进行转录组和蛋白质组关联分析，鉴定出109个与差异基因表达趋势相

9期南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析

2013，23（2）：99－110

1713

32个下调，同的差异蛋白，其中77个上调，这些差异

蛋白与光合作用、抗氧化物、信号传递、翻译后修饰、翻译和分子伴侣、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其

III类过氧化物酶、它及未知功能蛋白等相关。同时，

铁蛋白、谷胱甘肽S－转移酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂

LＲＲ类受体激酶、ABA反应蛋白、酶C、钙联接蛋白2、

+

液泡H－ATP酶C亚基和NADP－苹果酸酶等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白。本研究为深入认识紫

［12］OlgaA，Postnikova，JonathanS，LevG，Nemchinov．Analysisof

alfalfaroottranscriptomeinresponsetosalinitystress［J］．PlantCellPhysiology，2013，54（7）：1041－1055

［13］MaryM．Geneexpression：Transcriptometoproteomeandbackto

genome［J］．NatureＲeviewsGenetics，2011，12（8）：518

［14］ChristineV，MarcotteEM．Insightsintotheregulationofprotein

abundancefromproteomicandtranscriptomicanalysis［J］．NatureＲeviews，2012，13：227－232

［15］李培培，王接弟，孔广超．PEG胁迫下玉米基因表达谱分析［J］．

2014，33（2）：365－373基因组学与应用生物学，

［16］陈晶，韩贵清，尚晨，张海玲，李佶恺，刘慧莹，张月学．去除紫花

2015，24苜蓿叶片高丰度蛋白的方法及其应用［J］．草业学报，（7）：131－138

［17］XuJ，LanH，FangH，HuangX，ZhangH，HuangJ．Quantitative

proteomicanalysisoftherice（OryzasativaL．）saltresponse［J］．PLoSOne，10（3）：e0120978

［18］王雅娟，刘进文，方向群，李天志，王俊锋，郭英华，徐国纲，常德，

苏龙翔，姜学革，刘岩，陈振鸿，王立，刘长庭．空间环境诱导褪SM166的蛋白质组学分析［J］．解放军医学院学色沙雷菌LCT-2013，34（1）：10－13报，

［19］LanP，LiWF，SchmidtW．

Complementaryproteomeand

transcriptomeprofilinginphosphate-deficientArabidopsisrootsrevealsmultiplelevelsofgeneregulation［J］．Molecular＆CellularProteomics，2012，11（11）：1156－1166

［20］WhiteSL，GharbiS，BertaniMF，ChanHL，WaterfieldMD，

TimmsJF．CellularresponsestoErbB－2overexpressioninhumanmammaryluminalepithelialcells：comparisonofmＲNAandproteinexpression［J］．BritishJournalofCancer，2004，90（1）：173－181

［21］HuangS，ChenL，TeＲ，QiaoJ，WangJ，ZhangW．

ComplementaryiTＲAQproteomicsandＲNA-seqtranscriptomicsrevealmultiplelevelsofregulationinresponsetonitrogenstarvationinSynechocystissp．PCC6803［J］．MolecularBiosystems，2013，9（10）：2565－2574

［22］WangY，WangQQ，ZhaoY，HanGM，ZhuSW．Systematic

analysisofmaizeclassIIIperoxidasegenefamilyrevealsaconservedsubfamilyinvolvedinabioticstressresponse［J］．Gene，2015，566（1）：95－108

［23］NdimbaBK，ChivasaS，SimonWJ，SlabasAＲ．Identificationof

Arabidopsissaltandosmoticstressresponsiveproteinsusingtwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresisandmassspectrometry［J］．Proteomics，2005，5（16）：4185－4196

［24］ParkerＲ，FlowersTJ，MooreAL，HarphamNV．Anaccurateand

reproduciblemethodforproteomeprofilingoftheeffectsofsaltstressinthericeleaflamina［J］．JournalofExperimentalBotany，2006，57（5）：1109－1118

［25］ChenJ，JiangH，HsiehE，ChenH，ChienC，HsiehH，LinT．

DroughtandsaltstresstoleranceofanArabidopsisglutathioneS-transferaseU17knockoutmutantareattributedtothecombinedeffectofglutathioneandabscisicacid［J］．PlantPhysiology，2011，158（1）：340－351

花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了基础。参考文献：

［1］马小明．宁夏草畜产业的发展情况分析［J］．中国畜牧兽医文

2013，29（12）：8－10摘，

［2］WinicovI，ShizadeganM．Tissuespeicificmodulationofsalt

induciblegeneexpressioncallusversuswholeplantresponseinsalttolerancealfalfa［J］．PhysiolologyPlantarum，1997，100（2）：314－319

［3］GinzbergI，SteinH，KapulnikY．Isolationandcharacterizationof

twodifferentCdnasofDelta（1）－pyrroline5－carboxylatesynthaseinalfalfa，trascriptionallyinduceduponsaltstress［J］．PlantMolecularBiology，1998，38（5）：755－764

［4］MillerG，SteinH，HonigA．ＲesponsivemodesofMedicagosativa

prolinedehydrogenasegenesduringsaltstressandrecoverydictatefreeprolineaccumulatio［J］．Plantarum，2005，222（1）：70－79

［5］LuoY，LiuYB，DongYX，GaoXQ，ZhangXS．Expressionofa

putativealfalfahelicaseincreasestolerancetoabioticstressinArabidopsisbyenhancingthecapacitiesforＲOSscavengingandosmoticadjustment［J］．JournalPlantPhysiology，2009，166（4）：385－394

［6］JinHC，SunY，YangQC，ChaoYH，KangJM，JinH，LiY，

GruberM．ScreeningofgenesinducedbysaltstressfromAlfalfa［J］．MolecularBiologyＲeports，2010，37：745－753

［7］LongＲ，YangQ，KangJ，ZhangT，WangH，LiM，ZhangZ．

Overexpressionofanovelsaltstress-inducedglycine-richproteingenefromalfalfacausessaltandABAsensitivityinArabidopsis［J］．PlantCellＲeports，2013，32：1289－1298

［8］MaLC，WangYＲ，LiuWX，LiuZP．Overexpressionofan

alfalfaGDP-mannose3，5－epimerasegeneenhancesacid，droughtandsalttoleranceintransgenicArabidopsisbyincreasingascorbateaccumulation［J］．BiotechnologyLetters，2014，36（11）：2331－2341

［9］郭鹏，邢鑫，张万筠，姜健．紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基

2014，47因MsSIK1的克隆及功能分析［J］．中国农业科学，（23）：4573－4581

［10］申玉华，徐振军，唐立红，杨晓坡，黄文婕，武小斌，张文波．紫花

．苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析［J］2015，48（15）：2925－2938中国农业科学，

［11］YacoubiＲ，JobC，BelghaziM，ChaibiW，JobD．Proteomic

analysisoftheenhancementofseedvigourinosmoprimedalfalfaseedsgerminatedundersalinitystress［J］．SeedScienceＲesearch，

1714核农学报30卷

［26］ZhaoY，DongW，ZhangN，AiX，WangM，HuangZ，XiaoL，

XiaG．Awheatalleneoxidecyclasegeneenhancessalinitytoleranceviajasmonatesignaling［J］．PlantPhysiology，2014，164（2）：1068－1076

SMNuruzzamanManik，［27］董连红，史素娟，苏玉龙，刘朝科，冯祥

．国，胡晓明，王倩，刘好宝．植物CBL基因家族的研究进展［J］2015，29（5）：892－898核农学报，

［28］BustamanteM，HaslerU，LeroyV，deSeigneuxS，DimitrovM，

MordasiniD，ＲousselotM，MartinPY，FerailleE．Calcium-sensingreceptorattenuatesAVP-inducedaquaporin－2expressionviaacalmodulin-dependentmechanism［J］．

Journalofthe

AmericanSocietyofNephrology，2008，19（1）：109－116

［29］OuyangSQ，LiuYF，LiuP，LeiG，HeSJ，MaB，ZhangWK，

ZhangJS，ChenSY．Ｒeceptor-likekinaseOsSIK1improvesdroughtandsaltstresstoleranceinrice（Oryzasativa）plants［J］．ThePlantJournal，2010，62（2）：316－329

［30］XuZS，XiongTF，NiZY，ChenXP，ChenM，LiLC，GaoD

Y，YuXD，LiuP，MaYZ．Isolationandidentificationoftwogenesencodingleucine-richrepeat（LＲＲ）proteinsdifferentiallyresponsivetopathogenattackandsaltstressintobacco［J］．PlantScience，2009，176（1）：38－45

［31］MunnikT，VermeerJEM．Osmoticstress-inducedphosphoinositide

andinositolphosphatesignallinginplants［J］．PlantCellandEnvironment，2010，33（4）：655－669

［32］韩冬梅，柴晓杰，王逸云，刘世才，岳文静．杜氏盐藻磷脂酶C

．核农学报，基因DsPLC的克隆及盐胁迫下的表达分析［J］2014，28（10）：1773－1780

［33］DaniV，SimonWJ，DurantiM，CroyＲＲD．Changesinthe

tobaccoleafapoplastproteomeinresponsetosaltstress［J］．Proteomics，2005，5（3）：737－745

［34］ZhangL，TianLH，ZhaoJF，SongY，ZhangCJ，GuoY．

Identificationofanapoplasticproteininvolvedintheinitialphaseofsaltstressresponseinricerootbytwodimensionalelectrophoresis［J］．PlantPhysiology，2009，149（2）：916－928

［35］KoshibaT．ＲSOsPＲ10expressioninresponsetoenvironmental

stressesisregulatedantagonisticallybyjasmonate/ethyleneandsalicylicacidsignalingpathwaysinriceroots［J］．PlantCellPhysiology，2011，52（9）：1686－1696

［36］刘凌云，李娜，姚春鹏，孟飒飒，宋纯鹏．拟南芥中ABＲ蛋白

．科学通家族在ABA和逆境胁迫信号转导过程中功能分析［J］2013，58（27）：2751－2761报，

［37］贾栋，刘艳红，韩政，赵龙龙，吕向阳，马瑞燕．莲草直胸跳甲

Hsp70基因克隆及高温表达分析［J］．核农学报，2014，28（6）：970－977

［38］王荣青，万红建，李志邈，叶青静，阮美颖，周国治，姚祝平，

．核农学杨悦俭．番茄Hsp70基因鉴定及系统发育关系分析［J］2014，28（3）：378－385报，

［39］ChenX，WangY，LiJY，JiangAL，ChengYW，ZhangW．

Mitochondrialproteomeduringsaltstress-inducedprogrammedcelldeathinrice［J］．PlantPhysiologyBiochemistry，2009，47（5）：407－415

［40］GargG，YadavS，Ｒuchi，YadavG．KeyＲolesofCalreticulinand

calnexinproteinsinplantperceptionunderstressconditions：areview［J］．AdvancesinLifeSciences，2015，5（1）：18－26

［41］XuCX，ZhengL，GaoCQ，WangC，LiuGF，JiangJ，WangY

C．OvexpressionofavacuolarH+－ATPasecsubunitgenemediatesphysiologicalchangesleadingtoenhancedsalttoleranceintransgenictobacco［J］．PlantMolecularBiologyＲeporter，2011，29（2）：424－430

［42］LiuSK，ChengYX，ZhangXX，GuanQJ，NishiuchiS，HaseK，

TakanoT．ExpressionofanNADP-malicenzymegeneinrice（OryzasativaL．）isinducedbyenvironmentalstresses；over-expressionofthegeneinArabidopsisconferssaltandosmoticstresstolerance［J］．PlantMolecularBiology，2007，64（1/2）：49－58

［43］何美敬，刘立峰，穆国俊，侯名语，陈焕英，崔顺立．花生蔗糖合

．作物学报，酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析［J］2012，38（12）：2139－2146

JournalofNuclearAgriculturalSciences2016，30（9）：1706～1715

1715

CorrelationAnalysisonProteomicandTranscriptomicof

Salt-responseinLeavesofSouthernTypeAlfalfa

MAJin

ZHENGGang

PEICuiming

ZHANGZhenya

（SchoolofLandscapeArchitecture，ZhejiangAgriculture＆ForestryUniversity，Lin'an，Zhejiang311300）

Abstract：Integrativeanalysisofmulti-omicsdatawouldprovideinnovativeperspectivesonthecomplexmechanismsofplantadaptationtosaltstress．Inordertoinvestigatethemolecularmechanismofsalttolerance，thetranscriptomesandproteomicofsoutherntypeAlfalfa（Medicagosativa）“Millenium”leavesundercontrolconditionwerecomparedwiththoseunderNaCl-treatedcondition．TheresultsindicatedthatthecorrelationsbetweenthequantitativeproteinandmＲNAdifferentiallyexpressedproteinsandmＲNAexpressionwithoppositeexpressiontrend，differentiallyexpressedproteinsandmＲNAwithsameexpressiontrendwere0.2485，－0.2440and0.8122，respectively．Thenumberofthedifferentialexpressionproteinswhichwereexpressedatthesametrendwithdifferentialexpressiongeneswas109，amongwhich77and32weredetectedtobeup-anddown-regulated，respectively．Thesedifferentialexpressionproteinswererevealedtobeinvolvedinvariousbiologicalprocessessuchasphotosynthesis，oxidationresistance，signaltransmission，posttranslationalmodification，proteinturnover，chaperones，defenseagainststress，energyandtransport，metabolismandotheraswellasfunctionunknownproteins．Thedownregulatedproteinswereprincipallyinvolvedinphotosynthesis，whiletheupregulatedproteinswereoxidationresistance，signaltransmissionanddefenseagainststress．Candidatedifferentialexpressionproteinscloselyrelatedtosaltstressresistance，suchasclassIIIperoxidase，ferritin，lutathioneS-transferase，phosphatidylinositol-specificphospholipaseC，ABA-responsiveprotein，heatshock70kDaprotein，calnexin2，vacuolarH+－ATPasesubunitCandNADP-malicenzymewereselectedthroughcorrelationanalysesproteomicandtranscriptomic．Throughintegrativeanalysisofmulti-omicsdata，thepotentialtargetproteins（genes）foundinthispaperwouldlayasolidbasisforaholisticunderstandingofthemolecularregulatorymechanisminalfalfainresponsetosaltstress．

Keywords：southerntypealfalfa，saltstress，proteomic，transcriptomic，correlationanalyses