求助hoechst33258染色步骤
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发布时间：2022-04-22 09:13
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时间：2022-06-25 01:14
7.If staining for extracellular markers (i.e.: Sca-1, Lineage, c-kit, etc) then resuspend cells in 300mL of PBS, and stain cells on ice in dark for 30 minutes with antibodies. (N.B.: You can not use a PE antibody, as Pyronin Y fluorescence is in this channel, and you can not use a UV antibody, as Hoechst is in this channel.)
8.After staining, or if just spun down w/o staining, resuspend in 2mL of 5% paraformaldehyde.
9.Samples must sit at least overnight in 5% PFA in fridge, can sit for 1-2 weeks fine too.
10.When you want to add PY, make 1:100 dilution then add 10uL to each mL PFA (so, final dilution is 1:1000 from stock – but for some reason, it looks better if dilution is done in this stepwise fashion rather than dye added directly to cells from stock!)
11.Put tube in fridge for 30 minutes to incubate w/ PY.
12.Spin down, resuspend cells in 500mL 5% PFA, analyze.
13.When analyzing, remember that antibody fluorescence is log scale, PY fluorescence and Hoechst fluorescence are linear scale.
JianH：荧光显微镜可以配备有三种荧光：blue，green，UV。Hoechest只能用UV.
icepiao：Hoechst染色好像就是很浅，我曾用来检测过支原体，不知道你当时又没有固定细胞。
heartbeyond：我没有固定细胞，因为我要得到的是活的细胞，文章上看到的改种染色，颜色不是很浅，可是我的染色结果不是浅的问题，是踪影皆无，新买了染色剂，还是不行。会不会是荧光显微镜的问题
shifang99：我的方法和你差不多，但是染的效果很好，细胞核看得很明显的，而且半个月后，还是很清楚的。估计可能是你的显微镜的问题。我用的好象是蓝光啊。你再看看。你可以看看有没有其他的荧光标记物，染一下，做个对照检查一下。
wnwnwang：我也请教一个问题，由于我要到别的地方观察，我不想消化细胞后进行染色，而是直接在六孔板里进行染色，pbs洗，然后观察计数。不知道这样对贴壁的细胞而言，染色是否会不够充分，效果如何？
altbenair：第一次做检测凋亡，也不知道凋亡细胞应该是什么样的，而且我们的条件差，手工拍照。我们的荧光显微镜只有三种激发光颜色 不能调激发光波长。说明书是这样写的：透镜转盘位置，激发光颜色，适用荧光素。WB 蓝 FITC(绿色荧光) WG 绿 TRITC（红色荧光） WU 紫外 自发荧光
用WB WG 只有少数发绿色 和红色荧光的地方，用WU 可以清楚看到很多细胞 。
drake015：细胞核基本正常，属于正常细胞核，光线太亮。
照碧云天hoechst染出来的说法，只要核染出来比正常核小，而且亮度高就是凋亡细胞。他们的技术人员都在国外，没人能够提供详细的解释。都是染核的染料，结果应该差不多，不过一般我们作不出那么典型的图片。可是你那张图也实在不太象细胞核。
belgern: 观察物诱导肿瘤细胞的凋亡，仅只做光镜和荧光显微镜能说明问题吗？用Hoechst33258染色检测培养的细胞凋亡的具体方法是怎样的？涂片的载波片需特殊处理吗？
drake015: 最好再加一种流式计数或其他的方法。形态学加定量比较理想
belgern: 但如果我不想做细胞爬片，选择hoechst33342染色（因hoechst33342可以对活细胞直接进行染色），能否直接将染料加入培养液中，染色10min，弃培养液和染料，4%*4℃固定10min,弃固定液,直接将培养瓶放在倒置的荧光显微镜下观察呢?
drake015:呵呵，思路这么清楚摸索一遍有何妨？祝你成功！33258也可染活细胞的，我做过，33342没用过。有倒置显微镜我想可以直接染色。不过为什么不倒掉培养液再染？染料是固体？我想还是现配成溶液比较好。不管怎么说试验不难，可以试试看。
非关凋亡的讨论
future04：实验需要标记干细胞，有人说可以用Hoechst标记，可是我查的大部分使用来标记凋亡的，究竟Hoechest可以标记细胞吗？能维持多久？
dp：最好别用他来标记移植细胞,体内虽然可维持很长时间,但后期的污染现象(染周围的细胞)特别严重,根本无法分析你的结果.切记!我实验失败的严重教训.
cardiohong: 我的研究方向是干细胞移植，现在实验已经完成。主要是在体外将移植细胞以hoechst33342染色，而后植入体内。2周后取标本复查，荧光很好，而且非常密集；但4周后再检查的时候，荧光却踪影全无。我对这种现象很难解释。可能的原因不外乎：1、细胞死亡，2、细胞排出染料，3、染料荧光自然衰减，或发生猝灭。但查了查有关资料，一直没查到hoechst33342的荧光寿命，以及在什么条件下会猝灭。
midas: cardiohong 我对您的问题谈一些我的看法（个人观点，欢迎讨论），
首先我对细胞（包括干细胞）移植后的存活问题始终存有疑虑：且不说移植后的免疫排斥问题，我们谈谈细胞的外部生存条件：培养细胞在体外有充足的营养供应，有它适合生存的培养基及介质，然而到了体内它周围有什么？条件自然比体外要差的多。所以我认为不解决移植细胞在体内的存活问题，那么移植的可靠性和实用性就会大大！
我曾经用绿色荧光蛋白（一种标记细胞浆的荧光染料）标记嗅鞘细胞（体外观察很好），但是把它移植到正常的脊髓中，confocol结果发现一堆绿色的乱七八糟的小渣子，根本没有细胞的形态，但是用hoechst33342标记的，仍然有不少表面上显示正常的核的结构。从这一点上我们可以得出－－这时细胞的状态并不正常！虽然它们的核仍然完整。
下来谈谈hoechst的问题，hoechst是一种核酸特异性染料，与A－T键优先结合。因此在正常情况下hoechst荧光寿命的时间应该是较长的，直到A－T键被破坏。所以说荧光消失的问题就很可能是细胞死亡后，被周围的巨噬细胞吞噬消化掉的结果（如果没有完全消化，就仍然有荧光的显示）。
BlueSadNess: 首先Hoechst 33342 effulx是什么意思？是Hoechst 33342 拒染吗？
还有为什么干细胞（至少精原干细胞）会表现Hoechst 33342 efflux的特性？其原理是什么？
qjzhou2000: 不是拒染，而是能将染料泵出，所以在过流式的时候绘出现side-population的现象。至于具体原因还未明确，不过有些文章可以参考！
The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype
