求助成骨细胞分化ALP染色活性鉴定问题
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发布时间：2022-04-25 11:45
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时间：2024-03-26 10:11
目的：通过观察植物雌激素α玉米赤霉醇（α-ZAL）对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的作用，研究植物雌激素α-玉米赤霉醇对大鼠成骨细胞增殖、分化及蛋白表达的影响，探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇在骨代谢中的作用机理，以期为骨质疏松防治药物的研究开阔思路。 方法：1.采用二次酶消化法分离培养新生（24h）SD 乳鼠颅盖骨成骨细胞。2.应用钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红矿化结节染色来鉴定成骨细胞。3.应用噻唑兰(MTT)法测定植物雌激素α-玉米赤霉醇对成骨细胞增殖的影响。4.采用对硝基苯二钠基质动力学法检测了24 h和48h 成骨细胞碱性磷酸酶活性的改变。5.采用免疫组化法观察α玉米赤霉醇对体外培养成骨细胞的Bax、Bcl-2表达的影响。 结果：1.细胞形态学观察：刚接种的原代成骨细胞呈球形，24h内存活细胞已沉降贴壁，培养第2天能够完全展开，呈三角形、梭形，核明显增大；传代培养5天，细胞形态可见多样化，胞浆丰富，向外伸展，伸出多个伪足，与周围细胞的伪足相互连结，细胞半融合；培养一周左右，可见长索形、多角形、条索形，汇合时细胞呈铺路石状，可重叠生长。2.成骨细胞的鉴定：ALP 染色可见90％细胞染色阳性,胞质中出现灰黑色颗粒或块状沉积，矿化结节呈橘红色结节、边界清晰，可证明为成骨细胞。3.对大鼠成骨细胞增殖的影响：大鼠成骨细胞在含有不同浓度（10-5mol/L～10-10mol/L）α玉米赤霉醇以及含有10-10mol/L的雌二醇和无药物的培养基中培养24h后，与E2组比较，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 这两种浓度差异无显著性（P＞0.05），说明这两种浓度有促进成骨细胞增殖的作用4.对大鼠成骨细胞外碱性磷酸酶活性的影响：与正常组比较，三组均有显著性差异，与E2组比较，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 这两种浓度差异无显著性（P＞0.05），说明这两种浓度均可以促进成骨细胞分泌ALP。在促进成骨细胞分泌ALP的过程中，随着用药天数的增加，ALP 含量也增加。5. Α-ZAL对Bcl-2，Bax蛋白表达分析的影响：α-ZAL（10-7mol/L）组、α-ZAL（10-10mol/L）组抑制成骨细胞凋亡的作用。 结论：1.一定浓度的α-玉米赤霉醇可以促进成骨细胞的增殖分化，说明它们对骨都具有雌激素样活性。2.Bax/Bcl-2 参与成骨细胞的凋亡过程,一定浓度的α-玉米赤霉醇可以通过调节Bax/Bcl-2 起到关键*作用。
