可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?
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发布时间：2022-04-25 12:34
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热心网友
时间：2023-07-12 21:54
1，破细胞，高速离心收上清收集上清（同时平衡好柱子）；
2，既然你是His-tag，用Ni-NTA之类的柱子，两次上柱，buffer平衡；
3，低浓度咪唑（5mM）洗5-10柱体积，以洗去杂蛋白；
4，过梯度咪唑（10-500MM），用紫外检测仪监测280nm，收下每个峰；
5，用峰液跑SDS-PAGE，看哪个峰的蛋白浓度和纯度最为理想；
6，脱咪唑以及换buffer、脱盐，有两种基本方法：A，透析（经济、简便）；B，用脱盐柱（需要有仪器及柱子，更简便更省时）。
关于您说的蛋白没有活性的问题，我建议您在脱咪唑之前，就用峰液去测活性（如果咪唑不影响活性的检测手段），一般来讲，咪唑不会对蛋白的活性有太大影响。如果脱咪唑之前就已经没有活性，那就不是脱咪唑的问题，而是要往前追溯问题。比如，有无移码、tag对蛋白性质影响如何、破细胞的方法是否影响蛋白等等。
对可溶性蛋白的表达及纯化，我有多年经验，若有疑问，欢迎继续讨论。
热心网友
时间：2023-07-12 21:55
BL21表达的蛋白，先用裂解液测 粗酶活，看看是否有活性。
热心网友
时间：2023-07-12 21:55
你表达的蛋白不带纯化标记么？追问蛋白带his标记，目前的情况是用钴离子柱纯化后杂蛋白太多。纯化后用不含咪唑的洗脱液进行透析，想除去咪唑。这样做完后检测蛋白功能，发现蛋白没有活性。怀疑是纯化和透析咪唑出了问题。所以想请教大家：如何让我的目的蛋白更纯，咪唑能除干净
追答是不是纯化的柱子有问题呢？
