外显子捕获基本原理
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发布时间：2024-10-22 07:09
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时间：2024-10-22 14:44
外显子捕获的基本原理涉及从COS细胞中提取并处理DNA。首先，复制的附加体DNA经过性内切酶Dpn I的酶切，然后被转化到细菌中。筛选过程在特定条件下进行，即在含有卡那霉素(Kn)和5-氯-4-溴-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的培养基上，转化子菌落会根据是否产生卢-半乳糖苷酶的活性产生颜色变化。白色菌落的出现可能有两种解释：一是基因突变导致半乳糖苷酶失活，二是RNA剪接过程中发生变异，剪切掉了α,β-半乳糖苷酶基因。
如果白色菌落的出现是由于基因突变，通常意味着载体中"外显子捕获"部分的缺失。此时，可以使用人的口-珠蛋白基因片段作为探针，进行菌落杂交来快速验证这一假设。如果突变是由于RNA剪接，精确的剪接会移除IVS，使得人口-珠蛋白基因的第1外显子与被捕获的插入片段中的外显子序列相连接。这种连接可以直接用于测定序列，进一步确认剪接事件。
一旦捕获到外显子，就可以将其作为探针，用于从基因组基因文库或cDNA文库中分离出相应的基因。这种方法对于研究基因功能和变异具有重要意义，尤其是在研究遗传疾病和基因表达方面。
扩展资料
外显子捕获(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕获外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicing donor，SD)位点和剪接受体(splicing acceptor，SA)位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV—咀载体的克隆位点上游有一个“外显子捕获序列”(exon trap cassette)，可用来识别载体的插入片段中有无SA位点。
